Zahlavi

Hledání a nacházení rostlinných a houbovitých virů v Česku

Hledání a nacházení rostlinných a houbovitých virů v Česku

Mon May 30 11:29:03 CEST 2016

Pokud je pravdivý předpoklad, že každý vyšší organismus může být hostitelem virů, je pravděpodobné, že viry jsou nejpočetnější formou „života“ na této planetě, uvádějí ve svém příspěvku v Akademickém bulletinu Karel Petrzik a Ondřej Lenz z Ústav molekulární biologie Biologického centra AV ČR, v. v. i.

U všech velkých skupin organismů přitom najdeme viry s jedinečnou stavbou, uspořádáním genomu a unikátními vlastnostmi, které jim dovolují „žít“ v konkrétním druhu hostitele.

Odhady množství druhů potenciálních virových hostitelů se pohybuje v řádech milionů (PLoS Biology, 2011, e1001127). I když by mnoho organismů mohlo být osídleno stejným druhem viru, počet virových druhů by se měl pohybovat alespoň v řádech statisíců. Na druhou stranu, známe přes 400 různých virů, pro které je hostitelem jediný druh – člověk. V současnosti (březen 2016) obsahuje světová databáze GenBank informace o kompletním genomu přibližně 5500 druhů virů (téměř 2000 bakteriálních virů, kolem 1400 rostlinných virů, 1000 virů obratlovců, asi 400 lidských virů, přes 500 virů bezobratlých a přibližně 100 mykovirů) a o dalších asi 7000 částečně sekvenovaných virech. Stále tak lidstvo zná jen zlomek předpokládaného virového bohatství. Mohlo by se zdát, že vyhledávání a identifikace nových virů bude snadné, protože máme z čeho vybírat. Opak je ale pravdou.

V minulosti byly viry vnímány především jako agens, které svému hostiteli způsobuje nějakou újmu. Virologie k prokazování příčinné souvislosti výskytu viru a pozorovaného poškození hostitele vyžadovala plnění Kochových postulátů: izolovat virus, přenést na zdravého hostitele, pozorovat stejný typ symptomů, znovu izolovat virus. Postupovalo se přitom od nejviditelnějších viróz a poškození k těm méně výrazným. V centru pozornosti rostlinné virologie byly především ekonomicky důležité plodiny jako obiloviny, okopaniny, pícniny, ovoce, zelenina, okrasné rostliny. Dovolíme si tvrdit, že po tři čtvrtě století zkoumání už známe většinu virů, které způsobují významná poškození zemědělských plodin. Postupně však začalo přibývat případů, kdy virus nemohl být spojen s žádným prokazatelným poškozením hostitele. To se odrazilo mj. v pojmenovávání virů, kdy z jejich jmen začaly mizet přívlastky označující typické způsobované symptomy jako „mosaic“, „vein banding“, „dwarfing“, „streaking“, „ringspot“ a začaly se objevovat termíny jako „associated“, „symptomless“, „cryptic“ nebo „latent“ vyjadřující určitou míru nejistoty ohledně škodlivého dopadu na hostitele. Zjistit v hostiteli výskyt bezpříznakového viru je často více dílem náhody než cíleného hledání. Neexistuje totiž žádná fyzikální, biologická nebo molekulární metoda, kterou by se viry, variabilní co do fyzikálních, biologických a genetických vlastností, daly univerzálně a efektivně vyhledávat.

Ani bezpříznakové viry si však nemůžeme dovolit ignorovat. Z minulosti jsou známy případy, kdy dva relativně málo významné viry brambor působily ve směsné infekci synergicky a jejich kombinace vyvolala nový, významnější typ poškození než každý virus samostatně. Navíc ale viry – a většina to tak pravděpodobně dělá – nemusejí nějaké poškození vyvolávat vůbec. Některé z nich mohou naopak hostitelům prospívat. Unikátním příkladem vztahu mykoviru, houby a jejího hostitele, je soužití tropické trávy Dichanthelium lanuginosum s houbou Curvularia protuberata. Ačkoli je Curvularia příležitostným patogenem rostlin, v případě Dichanthelia jde o vzájemně prospěšný vztah, kdy Curvularia umožnuje trávě růst i při velmi vysokých (až 65 °C) teplotách půdy. Zjistilo se, že příčinou je virus nazvaný nepoeticky Curvularia thermal tolerance virus, který tuto schopnost u houby aktivuje (Science 315: 513–515, 2007). Co kdyby i některé další vlastnosti rostlin, které jsou pro nás důležité, byly podmíněny právě přítomností virů? Chceme-li znát odpověď na tuto otázku, musíme se zaměřit na viry, které se navenek neprojevují žádnou chorobou, a zkoumat, jakým způsobem ovlivňují svého hostitele.


Gemmamyces piceae (Kloubnatka smrková) rostoucí na PDA médiu

Čeští (a slovenští) virologové (například J. Brčák, O. Králík, J. Vacke, J. Pozděna, V. Průša, M. Musil a mnozí další) stáli v minulosti několikrát na začátku objevů nových rostlinných virů, když mezi prvními popisovali jejich výskyt, morfologii, přenosnost vektory, sérologické vztahy a další biologické vlastnosti. Tyto údaje až do osmdesátých let minulého století postačovaly k definování druhu viru. Nyní je nezbytným předpokladem popisu každého nového viru znalost jeho – pokud možno kompletní – genomové sekvence. Do hledání a sekvenování nových virů s využitím molekulárních a bioinformatických nástrojů jsme se pustili v průběhu devadesátých let poté, co jsme získali první amplifikátor. Od té doby jsme pracovali s viry na brukvovitých rostlinách, ovocných dřevinách, drobném ovoci, jahodách, chmelu a pícninách a získali jsme množství sekvenčních dat nejrůznějších rostlinných virů z České republiky. Zásadním způsobem potom naše možnosti rozšířilo zavedení masivně paralelního sekvenování (sekvenování nové generace, NGS), které umožňuje najednou sekvenovat veškerou dědičnou informaci obsaženou v daném vzorku: genom rostliny, jejíž list jsme použili pro izolaci, genom houby, která uvnitř tohoto listu rostla, genom hmyzu, jehož larvy se zrovna v utrženém listu vyvíjely, genomy přítomných bakterií, které se v listu, houbě nebo hmyzu zrovna vyskytovaly. Z obrovského množství takto získaných relativně krátkých (100–150 nukleotidů) úseků je zapotřebí složit smysluplný text a správně ho identifikovat. Vlastně to připomíná situaci, kdy máte rozstříhaný Shakespearův román (rostlinný genom) smíchaný s několika dalšími rozstříhanými knihami (genomy hub, hmyzu, bakterií) a snažíte se identifikovat text podobně „upravené“ krátké povídky – nový virus. Sestavení jeho kompletní dědičné informace tak mnohdy připomíná pověstné hledání jehly v kupce sena.

Mezi našimi nejnovějšími výsledky jsou nálezy dvou nových virů z výsadeb červeného rybízu: Currant virus A z rodu Capillovirus a Currant latent virus z čeledi Secoviridae. Viry byly zachyceny při identifikování směsných infekcí díky izolaci vysokomolekulární dvouvláknové RNA (dsRNA), která v rostlinách signalizuje výskyt RNA virů. Tato nukleová kyselina byla dále podrobena NGS a bioinformatické analýze. Obdobným postupem jsme objevili i další, dosud nepopsané viry v třešňových stromech, jejichž genom nyní kompletujeme.

V posledních pěti letech se oblast našeho zájmu rozšířila z kulturních plodin i na viry přítomné v méně prozkoumaných organismech, jako jsou lišejníky, řasy a mikroskopické houby. Především poslední skupině organismů je celosvětově věnována velká pozornost, protože představují velmi početnou, různorodou, v biosféře nezastupitelnou a všudypřítomnou skupinu hostitelů. V houbách jsou stále nacházeny viry s novým složením genomů a unikátními vlastnostmi, které u jiných virů neznáme.

Velmi pozoruhodným efektem působení mykovirů je hypovirulence. Jde o jev, kdy houba, která obsahuje určitý virus, je méně patogenní než samotná houba bez viru. Takto oslabené houby lze použít pro biologickou ochranu rostlin před razantními divokými kmeny. Viry s hypovirulentním účinkem nalezneme ve virových čeledích Chrysoviridae, Hypoviridae, Narnaviridae, Partitiviridae, Reoviridae a Totiviridae. Mechanismus vzniku hypovirulence však bohužel stále neznáme. Je dokonce možné, že jich může být ­více, zvláštní pro každý typ virového genomu. Příkladem viru, který způsobuje hypovirulenci, je i námi popsaný nový druh Phomopsis longicolla hypovirus. Ten jsme nalezli v nestandardně rostoucím izolátu houby Phomopsis longicolla, která je významným patogenem na sóje (Glycine max). Její hypovirulentní účinky dále zkoumáme.

Jiným způsobem je pozoruhodná houba Beauveria bassiana. V prostředí je velmi rozšířená a vyniká především vysokou patogenitou vůči různým druhům hmyzu. Proto se komerčně využívá jako univerzální mykoinsekticid. V jednom z českých kmenů této houby jsme zjistili přítomnost dsRNA, jež náležela novému viru s unikátním složením genomu, pro který jsme navrhli zřízení nového rodu Amalgamycovirus. Virus však houbě nijak neškodil a na umělém médiu rostla houba s virem stejně dobře jako houba bez něj.


Rozmanitá říše hub (Fungi) skrývá dosud nepoznané bohatství mykovirů.

Zatím nepoznaným způsobem je s virem spojena houba Gemmamyces piceae (kloubnatka smrková). Ta je nejvýznamnějším houbovým patogenem smrku pichlavého. U nás byla nalezena prakticky ve všech horských oblastech, ale největší škody způsobuje její epidemický výskyt ve vrcholových partiích Krušných hor. Přitom všech 40 zkoumaných vzorků houby z Česka bylo infikováno dosud neznámým virem Cucurbitaria piceae partitivirus 1. Otázkou nadále zůstává, zda přítomnost viru v kloubnatce její projevy zeslabuje, nebo naopak zesiluje.

Dosud málo probádanou oblastí je i šíření mykovirů. Mnoho z nich se šíří rozmnožovacími partikulemi (spórami) nebo fúzí hyf při přímém kontaktu. Jen ojediněle se povedlo přenést houbový virus do jiného hostitele pomocí izolovaných virových částic. Šíření mykovirů tak spíše připomíná šíření bakteriálních plazmidů, které se také nevyskytují v „infekční“ podobě volné mimo prostředí hostitelské buňky, než šíření rostlinných virů. Přitom v prostředí žije velké množství různých organismů, jež se živí houbovými pletivy a mohly by tak zprostředkovat přenos virů do jiných druhů hub. Zatím ojediněle byla zjištěna přítomnost unikátního Thelephora terrestris viru 1 ve dvou druzích půdních roztočů. V populacích jednoho z nich, Steganacarus carinatus (zákolníka teplomilného), se virus vyskytoval neobvykle často a je tak možné, že roztoč přece jen hraje v šíření viru nějakou významnější úlohu.

Zvláštní skupinou virů jsou ty, které netvoří ochranný obal – tzv. kapsid – a jsou složeny jen z infekční dědičné informace. Jeden takový jsme identifikovali během analýzy dat z NGS viromu houby Phomopsis longicolla. Velmi malý virový genom o délce kolem 2800 nukleotidů kóduje jen gen pro virovou RNA polymerázu, která zajišťuje kopírování dědičné informace. Protože RNA polymeráza je u tohoto viru překládaná do bílkoviny podle pravidel kódování mitochondrií, pravděpodobným místem působení viru jsou právě mitochondrie P. longicolla.

Naše úsilí při vyhledávání a popisu nových neznámých virů je paralelou k úsilí klasických taxonomů od 18. století. V submikroskopickém světě virů už ale používáme poněkud sofistikovanější metody. Rychle přibývající údaje z NGS nám postupně odhalují, že kolem nás existuje množství dosud nepoznaných virů. Jejich životní strategie ve velké míře nezpůsobuje hostiteli viditelná poškození a viry se přesto udržují v evoluci miliony let. Nám se tak nabourává tradiční představa viru jako něčeho škodlivého, čeho je třeba se za každou cenu zbavit. Některé viry (a je jich odhalováno stále více) se staly přímo součástí genomů hostitelů, kde získaly jiné funkce, než známe u volně žijících virů, často pro hostitele klíčové. Je pravděpodobné, že také řadu zásadních genů důležitých pro evoluci získaly prabuňky z tehdejších virů. Objevování nových virů a způsobů, kterými fungují, tak není jen samoúčelným zvyšováním počtu známých druhů, ale vede i k poznání toho, jak život vlastně funguje. Už nyní je jasné, že bez virů by život na této planetě nebyl. Alespoň ne v podobě, v jaké ho známe dnes.

KAREL PETRZIK a ONDŘEJ LENZ,
Ústav molekulární biologie
Biologického centra AV ČR, v. v. i.

Oddělení rostlinné virologie Ústavu molekulární biologie rostlin je součástí Biologického centra AV ČR v Českých Budějovicích. Zabývá se etiologií, detekcí, popisem a sekvenováním rostlinných virů, mykovirů a fytoplazem. V současnosti má 11 vědeckých pracovníků a doktorandů, kteří tak představují největší skupinu rostlinných virologů v ČR.